心血管重塑相关疾病教育部重点实验室

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科学研究

科研进展

2015:心血管重塑相关疾病研究阶段性进展——心血管重塑相关疾病的分子病因学研究

发布时间:2016-01-12 17:33:11
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1.主动脉瘤易感位点筛选及早期预警、诊疗方案的建立

(1)主动脉瘤资源库的建立

杜杰教授团队建立了高质量的我国主动脉瘤患者的生物资源库。运用二维码低温标签制作系统制作样本标签,运用冻存管理系统对样本进行管理,选择符合国际上公认的规范和标准的RuRoFreezerPro样本信息管理软件对样本进行管理。

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二维码低温标签制作系统冻存管理系统

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RuRoFreezerPro样本信息管理软件

(2)主动脉瘤易感基因的筛选

建立了高通量测序平台,包括illuminaHiseq 2500高通量测序仪、Miseq高通量测序仪、Nextseq高通量测序仪、Massarray飞行质谱仪。运用外显子定点捕获方法对146例散发胸主动脉瘤/主动脉夹层患者进行FBN1基因外显子测序,测序及分析流程见图1。应用生物信息学分析的方法,在146例散发胸主动脉瘤/主动脉夹层患者中找到23个突变位点,其中17个为我们新发现的位点(图2)。其中位点Ala27Thr位于FBN1信号肽区域,在146例患者中重复出现了2次。进一步在666例散发胸主动脉瘤/主动脉夹层患者及1500例正常对照中进行分析,发现Ala27Thr在散发胸主动脉瘤/主动脉夹层患者中比例为1.5%,在正常人中比例为0.47%,二者具有显著统计学差异。对某些突变位点进行3D结构分析,发现这些突变位点不仅影响了蛋白结构,也影响了蛋白功能(图4)。通过基因型-表型相关性分析,发现不同类型的FBN1突变,主动脉直径明显不同(表1)。并且有FBN1突变的患者,其发病年龄要明显早于没有FBN1突变的患者(表2)。(工作发表在Scientific Reports. 2015)。对于没有发现FBN1突变的患者,我们进一步进行全基因组外显子测序,以检测其是否有其他致病基因突变,并且通过生物信息学分析,找到新的导致胸主动脉瘤/主动脉夹层的致病基因,下一步拟在大样本人群中检查新致病基因分布情况或通过动物模型对新致病基因进行功能验证。

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表1. Analysis of clinical conditions in patients with different FBN1 genotypes.

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表2. Comparison of clinical parameters of patients with and without FBN1 mutations.

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(3)以病理学、动物模型、无创影像学、流行病学为基础,利用生物信息学发现主动脉瘤分子病因学

A)基于美国Charpenitier E等人2013年发表于Nature的最新技术,如下图,快速建立人源化小鼠,携带人类突变基因的系统快速建立。

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基于CRISPR-Cas的基因编辑系统(引自Nature. 2013;495(7439):50-1)

B)建立了腹主动脉瘤模型和主动脉夹层模型

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腹主动脉瘤模型主动脉夹层模型

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采用化学药物诱导成功建立主动脉夹层模型

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补体因子Factor H mutation 促进了主动脉夹层的形成

C)利用小动物超声对腹主动脉瘤做出无创诊断,如下图:

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(4)建立主动脉瘤分子分型、早期诊断、早期预警及早期干预体系

利用Bioplex系统,可以对50种以上的人类炎性因子、30种以上的小鼠炎性因子、9种大鼠炎性因子进行检测(下图)。

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Bioplex系统可检测的炎性因子种类

2.心肌病病因学研究

心肌病是一种原因不明的心肌疾病,它不包括病因明确的或继发于全身疾病的特异性心肌病。心肌病可分为三种:扩张型心肌病(DCM),肥厚型心肌病(HCM)和限制性心肌病(RCM)。其中以HCM和DCM较为常见。HCM患者常有严重症状,易发生房性、室性心率失常以及猝死。DCM临床表现为进行性心力衰竭(心衰)、左室收缩功能下降、室性及室上性心律失常、传导系统异常、血栓栓塞及猝死,并可发生在病程中任何阶段的疾病,对家庭和社会造成严重的负担,是心衰的第三大病因及心脏移植最常见原因。对HCM和DCM传统的诊断方法只能在心肌出现不可逆病理改变之后才能做出诊断,且不能预测猝死发生的危险性,因此若能在此前对预后做出判断,并对高危患者进行干预,意义十分重大,基因突变的研究使这成为可能。

心肌病的发病原因至今未明。DCM的分子遗传学研究成果有家族史的约占20%~35%,已报道的30多个DCM的致病基因主要是由心肌结构蛋白突变。50%的HCM患者有遗传倾向,散发病例逐年增多,现已报道的与该疾病有关的致病基因主要为10多个心脏肌小节基因,总计有几百个突变位点。但目前这些资料均来自国外,中国的HCM或DCM的遗传学基础目前还不清楚,有关中国人群的心肌病的基因分布及基因突变数据库目前尚未作系统研究。勾划我国心肌病的致病基因分布情况,探询基因型与表现型的关系,对病人进行早期的危险分层,早期预防,改善生存质量及延长患者的寿命意义重大。

课题组已开展心肌病致病基因的初步研究工作。已收集国人HCM样本300余例和DCM样本100余例,建立了中国汉族人群HCM和DCM遗传样本库平台,收集了患者的临床资料,包括体检、心电图、超声心动图检查。已经建立基因诊断的基因捕获测序试剂盒,并采用此技术,对收集到的心肌病样本的目标区域进行个体化捕获测序,对其目标序列进行生物信息学分析。目前已为多个肥厚型心肌病家系确定了个体化的致病基因,从基因水平进行了确诊,同时对已知致病基因在中国汉族HCM人群的分布情况进行了全面的估价。对于未找到致病突变的家系,课题组采用了全外显子捕获测序技术,去寻找国人心肌病的新的致病基因,并去了解新致病基因与国人心肌病发生发展的关系。

前期工作利用实验室设计的捕获试剂盒对117个肥厚型心肌病患者,进行了目标区域捕获测序。对22个已知致病基因进行数据分析后,共发现21个已知致病突变,同时,为多个肥厚型心肌病的家系作出了基因诊断。在未发现已知致病突变的样本中,经过数据库的过滤,位点致病性分析,最终发现28个新致病,这些新致病突变将进行遗传学和功能学的验证,明确这些致病突变的作用机制。MYBPC3 基因是HCM一个重要的致病基因,能解释35%的HCM患者。对于前期114个HCM患者进行目标 基因捕获测序的数据进行深度分析之后,对MYBPC3基因的突变谱进行了勾画,发现了12 个已知突变位点和8个新突变位点,并对基因型和临床表型的关系进行了分析,发现了p. Y842X热点突变,导致临床严重表型。成果于2015年6月以SCI文章的形式发表于Scientif ic Reports(IF:5.578, Sci Rep. 2015 Jun 19;5:11411)上

Summary of detected mutations in MYBPC3 by deeper sequencing

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Analyses of HCM phenotype and MYBPC3 genotype

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兰峰教授研究主要基于在心血管疾病机制的研究,延续了所采用的经典心脏生理学分析技术,并增添了目前最新的细胞分化培养技术和高通量测序技术,大大加强了原有HCM研究的创新性。对于本研究中所采用的几个关键的新技术,进行了前期探索性实验,并且取得的较为理想的结果,汇报如下:

尿样细胞收集与重编程

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A. 刚贴壁并开始分裂的尿样细胞B. 尿液上皮细胞形成的细胞群 C. 重编程过程中的尿液上皮细胞中出现的iPSCs样克隆 D. 挑取后培养扩增的iPSCs。

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不同密度下iPSCs-CM基因表达的差异

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不同培养时间iPSCs-CM基因表达的差异,细胞年龄从未分化iPSCs的0天到180天。

3.肺动脉高压的遗传学研究

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是以肺血管压力、阻力进行性升高和右心功能衰竭为主要特征的临床病理生理综合征或疾病,其致残率和死亡率高,并且发病率呈逐年增长趋势,已成为我国重大医疗保健问题之一,同时也是国际前沿研究的热点。尽管近年来,靶向药物的出现,使PAH的治疗取得了显著进步,但是其临床和预后的改善程度仍然有限。因此进一步明确PAH发病机制,寻找有效的新干预靶点是当今医学界关注的热点问题。

肺动脉高压的病理改变表现为血管内皮细胞损伤和平滑肌细胞的增生,同时还可伴有细胞外基质的增加。多种生长因子及其受体、神经激素和细胞因子都参与了这种病理形态的改变。上述几种介质的表达水平在一定程度上都由各自的基因所调控。骨形成蛋白2型受体、五羟色胺、五羟色胺转运体,前列环素受体、前列环素合酶、电压门控的钾通道、一氧化氮、内皮素-1,内皮素A受体、B受体和活性氧等基因编码区域的改变都可能与肺动脉高压的形成有关。因此,对上述蛋白质基因调控的理解,比如对蛋白质的基因多态性和基因突变的认识等,将有助于我们更为深刻的认识肺动脉高压的病因、预后以及治疗等。

我们已开展肺动脉高压致病基因研究项目。收集符合国际标准的肺动脉高压患者临床信息和生物标本(血浆、DNA标本)300余例;收集符合国际标准的主动脉瘤患者临床信息。我们选取其中遗传性肺动脉高压14例,特发性肺动脉高压100例,先天性心脏病并发肺动脉高压186例,收集血液和提取DNA,进行个性化捕获外显子测序。测序结果经分析后已发现数个已知致病基因的新突变位点。通过生物信息学分析,发现多个候选易感基因。设计肺动脉高压及其他心血管疾病相关的300个基因捕获试剂盒,用来进行肺动脉高压的分子诊断。

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Fig 1 Diagram of strategy

TGF-β超家族成员中,对骨形成蛋白II型受体(BMPR-II)基因突变的研究最早也最为深入,研究发现BMPR-II基因不仅是部分西方白种人群FPAH的致病基因,而且26%的特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)患者也有此基因突变。我们在研究中发现100个患者中,有17例患者中有BMPR2基因突变,其中9例为已知突变位点,8例为新的位点突变。TGF-β信号转导通路另外一种受体活化素受体样激酶1(ACVRL1)的研究发现,PAH患者丛样病变的肺血管内皮中存在ACVRL1蛋白产物,同时国外学者在PAH动物模型中发现ACVRL1基因缺陷小鼠会自发肺动脉压力增高。我们在研究中发现1个家系中发现ACVRL1突变,2个特发性肺动脉高压患者中发现1个ACVRL1突变,其中2例为新的位点突变。下面是我们在一个遗传性肺动脉高压家系中进行候选基因个性化捕获及外显子测序,测序结果经与公共网站或文献对照,排查肺动脉高压已知致病基因的SNPs或InDels。同时相关新位点突变进行了细胞功能验证。结果是如下:

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Fig 2 novel mutation in the patients of PAH

虽然我们在PAH 分子遗传学研究方面已经取得了不少结果,还有一些问题待解决。首先,在同一个家族中,为什么具有同样的BMPR-Ⅱ基因突变的家族成员一部分发病,而另一部分不发病?其次,一些已故基因可能参与PAH 发病的基因包括:编码SERT 启动子、一氧化氮合成酶、血管紧张素Ⅱ、内皮素或者血管活性肠肽基因。我们对这些基因可能作为BMPR-Ⅱ基因的修饰基因来参与的PAH的发病。将这些基因和BMPR-Ⅱ基因表达联合起来进行研究,能否找到解释PAH的不完全外显和个体易感性的答案?最后,随着治疗PAH的多种药物的出现,我们还应该进一步研究是否可以用基因的多态性来解释不同的患者对同一种药物的反应性的不同。这些都是我们的以后的工作中继续进行研究,以解决实际的临床问题。

4.肠道菌群与心血管重塑相关疾病研究进展

肠道菌群是人体胃肠道微生物的主要部分,其数量约为人体体细胞总数的10倍,编码的特异基因则约为人类基因组编码基因数目的150多倍,它们作为人体重要的内环境成分,对于维持人体的正常生理功能有重要影响,也被认为是人体的又一种"器官"。近十年来,对于肠道菌群的研究已经成为新的研究热点, 已知菌群会影响人体对于食物的消化和吸收,调控人体的炎症免疫反应,调节人体的神经内分泌递质从而影响行为和情绪,影响药物的效果,菌群失调会导致肥胖、糖尿病、心血管疾病、肠炎、肿瘤等诸多疾病,但发病的具体机制仍有待深入探索,并且由于菌群具有明显的地区、民族差异性,因此不同国家和地区的人群具有不同的肠道菌群特征。

在此领域中,我们选择以肠道菌群与儿童肥胖的关系作为研究的切入点。这是因为,肥胖是包括我国在内的全球各国普遍面临的重大公共卫生问题之一,其发生率和肥胖人群的绝对数量增加很快,发生年龄阶段越发低龄化。同时,肥胖是导致糖尿病、心血管疾病等代谢疾病的重要危险因素,青少年肥胖更会极大增加成年后罹患糖尿病和动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的概率,甚至直接诱发青少年高血压疾病。国外大量的人群调查和动物实验证实,不同种系型(phylotype)的肠道菌群,对于维持宿主的体重或者导致肥胖有直接作用,比如对无菌小鼠分别移植来自正常体重受试者或肥胖受试者的粪便菌群,则移植了"肥胖型"菌群的小鼠其体重增加更快、身体脂肪比例更大。因此探明肠道菌群参与肥胖发生的作用,不仅能够更好的防治青少年肥胖,更可以提供对肥胖相关疾病的早期预警和早期治疗的新指标。

我们的前期工作通过与北京市儿研所、北京市朝阳区中小学保健所合作,在朝阳区的五所小学开展常规体检调查和粪便样本采集工作。儿童根据其年龄、性别、BMI(身高体重比,kg/m2),综合参照现行的中国学龄儿童青少年超重、肥胖筛查体重指数值分类标准和美国CDC的BMI分级标准进行分组,选择间隔一年仍保持BMI分级不变的典型的正常体重(HW)和肥胖组儿童(OB)各29例和36例,对其在一年前后收集的两个批次的粪便样本进行菌群结构分析。具体方法是从冻存的新鲜粪便样本中提取DNA,使用罗氏454型测序仪对于DNA样本中细菌16S rDNA的V3~V5可变序列区域进行测序分析,测序结果经过筛选、聚类,再与细菌GreenGene数据库进行比对,确定种属归类,进行进一步的统计学和生物信息学分析,包括物种多样性、细菌种属比例、网络关系、功能基因预测等。两个批次的分析结果做进一步比较,保留共同的胖-瘦菌群差异。初步结果如下:

(1)对细菌种属的百分比进行统计分析,找到了肥胖组与正常体重组有显著丰度差异的一些细菌。下图为门级和属级的细菌比例情况:

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(2)差异细菌带来了细菌网络的改变。下图分别为Spearman网络和Co-abundance group网络,分别展示细菌节点直接联系和子网络联系的区别。

Spearman network

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CAG network

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(3)网络的改变进一步导致了菌群功能的持续变化。下图为两次测序预测细菌功能有恒定差异的一些功能通路。

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这些研究结果正在撰文准备投稿。以此为基础,已经获得教育部第49批留学回国人员科研启动基金资助,并开展了与临床科室的多项合作研究工作。此外,立足于肠道菌群检测方法,我们还承担了农业部转基因安全性重大专项课题的一项子课题,检测了转基因玉米对于小鼠肠道菌群和其他生理指标的影响,相关研究结果已经获得一项国家专利.

5.心血管疾病特异生物标志物的筛选

心血管疾病是目前威胁大众健康的一个急待解决的问题,心肌梗死、卒中和心源性猝死给社会和家庭造成极大的伤害。如何早期识别发生心血管疾病高危人群,采用何种方法判断未来发生心血管疾病几率;对高危人群进行预防性干预并采用一种方便的监测方法了解治疗的效果,已成为人们努力的方向和目标。随着对心血管疾病发病机制认识的不断深入,生物标志物在心血管疾病早期诊断、危险分层、预后评估及治疗策略方面的应用价值已成为近年心血管病领域研究的热点之一。临床上广泛应用的肌钙蛋白I (troponin I, TnI)、肌酸激酶同工酶 (creatine kinase isoenzyme, CK-MB) 是在心肌发生实质性坏死后才升高的,而且在发作早期心肌损伤前心电图及上述指标均可能没有变化,因而耽误了治疗。因此寻找新的、准确、快速、可靠的心血管生物标志物对诊断急性心肌梗死极具价值。随着基因组学,蛋白组学和系统生物学的迅猛进展,大量生物信息的不断涌现,确定心血管疾病的生物标志物已经成为一种迫切的需求。

目前已报道的生物标志物主要分为如下几类:1 ) 脂蛋白相关标志物(低密度脂蛋白、载脂蛋白A1/B);2)炎症相关标志物(如白介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子(TNF)-α);3 )肌钙蛋白(cTn、包括cTnI和cTnT);4)脑钠肽(BNP)和N端B型脑钠肽前体(NT-proBNP)等等。结合目前已经报道的心血管生物标志物,开展多标志物悬液芯片研发;应用生物质谱、生物芯片技术,对6种标志物进行临床样本的检测。共完成对对冠状动脉粥样硬化性心脏病(2000个)、心梗(2000个)、主动脉瘤(2000个)慢性心衰(1000个)和正常对照(2000个)样本进行潜在的心血管标志物ST2、IL33、Galectin3、PTX3、GDF15及MPO的检测。

我们建立了液质联用质谱平台Q Exactive和TSQ Quantum Ultra。基于该平台进行如下研究:

1) 应用定量和靶向质谱技术在心血管患者血浆对代谢产物进行评估和检测,将前沿的代谢组学研究转化为临床检测方法。制定质谱定量检测氨基酸类、有机酸类(花生四烯酸)及维生素族的标准操作规程和工作流程,建立氨基酸检测平台,有机酸检测平台,维生素族检测平台。

2) 建立一个相对完整的包括目前已知的用于临床诊断的心血管标志物的稳定的代表肽段库和相应的MRM质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术检测方法,确定21种候选蛋白及相应代表肽段76个的MRM检测肽段库,并完成了质谱检测方法,服务于以后心血管疾病患者生物标志物的质谱检测。

时间分辨荧光免疫分析金属利用稀土螯合物荧光寿命长,stokes位移小等特点达到在蛋白质检测灵敏度高,特异性好的优点。我们合成了新型的稀土标记物,对抗体进行了标记,包被之后得到了相应的标准曲线,为生物标志物的检测提供了新的思路和方法。

本项目的主要研究内容是针对与心血管重塑相关的冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、心梗后心脏重塑、慢性心衰和主动脉瘤的早期诊断、个性化治疗的关键临床问题,应用生物质谱、生物芯片技术,对具有潜在诊断作用和重要临床应用价值的血清标志物进行临床样本的检测和验证,并结合生物信息学、流行病学、统计学分析,筛选出新的生物标志物,为疾病防治的早期化和个体化提供科学指导。

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